固定時(shí)間對原位雜交的影響

                                     作者：馬云 張連國 張輝 周翠玲 劉穎

【摘要】  　　目的 研究組織固定時(shí)間對原位雜交的影響。方法 選擇了18個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)的胃癌組織標(biāo)本，用兩種探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 固定時(shí)間為8～24 h胃癌組織胞核陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及平均光密度為（84/0.40），明顯高于其它組；固定時(shí)間為6～16 h胃癌組織胞漿陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及平均光密度為（84/0.40），明顯高于其它組。結(jié)論 胃癌組織胞核陽性最佳固定時(shí)間為8～24 h，胃癌組織胞漿陽性最佳固定時(shí)間為6～16 h。 
【關(guān)鍵詞】  固定時(shí)間　原位雜交
　　【Abstract】  Objective  To study the effect of fixing tissue at different time on ISHH.Methods  The experimental tissues fixed with different time were divided into 18 groups, which were examined the mRNA expression of p53，c?myc using ISHH .WTHZ]Results  The number of positive neurons and average optical density value of tissue fixed for 8?24 h were higher than that of others. The number of positive cytoplasm and average optical density value of tissue fixed for 6?16 h were higher than that of others.Conclusion  The best time of fixing tissue neurons is 8?24 h for ISHH,the best time of fixing tissue cytoplasm is 6?16 h for ISHH.
　　【Key words】  time of fixing tissue, ISHH
　　原位雜交（ISHH）屬于固相分子雜交范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針在原位檢測組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法,它不僅保持了細(xì)胞固有形態(tài)而且對被測物準(zhǔn)確定位。因此，ISHH已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的鑒定、預(yù)后分析及相關(guān)學(xué)科的研究之中。研究發(fā)現(xiàn)［1，2］，不同固定劑對原位雜交結(jié)果有明顯影響，作者在長期的工作中發(fā)現(xiàn)組織固定時(shí)間亦是影響雜交結(jié)果的重要因素。本文選擇了18個(gè)固定時(shí)間點(diǎn)的胃癌組織標(biāo)本，用探針進(jìn)行研究，擬尋找適用的固定時(shí)間段，為提高原位雜交染色方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性提供參考依據(jù).
　　1  材料與方法
　　1.1  材料  胃癌標(biāo)本30例為病理科送檢標(biāo)本，每例取大小為1 cm×2 cm×0.2 cm組織塊若干固定于多聚甲醛中,固定時(shí)間分別為1、2、4、6、8、12、16、24、48、72 h間及1、2、4、8、12、24、48、72周。P53 、c?myc雜交試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品。
　　1.2  方法  原位雜交：切片58 ℃烘烤過夜,二甲苯脫蠟6 h，梯度酒精水化，DW洗片，PB洗片，0.1DHCL室溫10 min，PB洗片，微波(甘氨酸?鹽酸緩沖液)處理，三乙醇胺?無水乙酸處理，梯度酒精處理，風(fēng)干后滴加探針42 ℃雜交20 h，42 ℃ 2×SSC洗片，37 ℃ 0.1×SSC洗片，滴加辣根酶標(biāo)記的Dig抗體37 ℃孵育 2 h，PB洗片,滴加SABC 37℃ 1 h,PB洗片, DAB 顯色，甲基綠或蘇木素復(fù)染。
　　1.3  圖像分析  每片組織隨機(jī)取10個(gè)陽性視野，以測出平均視場（261 632 μm2）內(nèi)的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及陽性信號的平均光密度。
　　2  結(jié)果
    
　　對固定24 h的組織原位雜交方法預(yù)實(shí)驗(yàn)3次，在30例送檢標(biāo)本選出8例p53 、c?myc雜交均陽性標(biāo)本，對這8例標(biāo)本的切片按所設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)近一步研究。
    
　　各不同固定時(shí)間組對所測探針均有不同程度的表達(dá)見表1。將每個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的平均陽性細(xì)胞數(shù)及平均光密度進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，可見：對于胞核呈陽性的組織，固定時(shí)間在1～8 h內(nèi)曲線呈上升趨勢，8～24 h到達(dá)峰值，24 h后曲線呈下降趨勢，至100 h后曲線開始平緩，由此可知，原位雜交中組織胞核陽性最佳固定時(shí)間為8～24 h(圖1)；對于胞漿呈陽性的組織，固定時(shí)間在1～6 h內(nèi)曲線呈上升趨勢，6～16 h到達(dá)峰值，16 h后曲線呈下降趨勢，至100 h后曲線開始平緩，由此可知，原位雜交中組織胞漿陽性最佳固定時(shí)間為6～16 h（圖2）。

表1  不同固定時(shí)間陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)及信號的光密度（略）
　　圖1  固定12 h的組織 P53胞核陽性(×400)（略）
　　圖2  固定6 h的組織，c?myc胞漿陽性(×400)（略）
　　3  討論
    
　　多聚甲醛是通過醛基與組織內(nèi)的某些蛋白質(zhì)成分發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，迅速終止組織內(nèi)各種酶活性，從而防止細(xì)胞自溶，保存細(xì)胞的固有形態(tài)。但這樣廣泛的交聯(lián)而掩蓋了特定核酸序列，影響雜交探針與被測基因結(jié)合位點(diǎn)的整合。固定時(shí)間適當(dāng)可應(yīng)用微波或蛋白酶打開交聯(lián)恢復(fù)蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)，重新暴露特定核酸序列，但固定時(shí)間太短又導(dǎo)致組織固定不足，使組織中心部位的特定核酸序列溶解、彌散、丟失。一旦固定時(shí)間過長，可使被測基因片段的結(jié)合點(diǎn)被牢固封閉，故組織固定時(shí)間是特定核酸序列能否得到良好保存、ISHH能否成功的關(guān)鍵因素。
    
　　本實(shí)驗(yàn)顯示，固定時(shí)間與原位雜交的結(jié)果密切相關(guān)，當(dāng)組織固定不好(0.5 h固定組)所測探針沒有表達(dá)，固定達(dá)1 h后,表達(dá)率與時(shí)間開始呈正相關(guān).胞漿陽性達(dá)6 h后到高峰，直至16 h后慢慢下降與時(shí)間呈負(fù)相關(guān),胞核陽性8 h間后至高峰直至24 h后慢慢下降與時(shí)間呈負(fù)相關(guān),這可能與多聚甲醛的固定機(jī)制有關(guān)。多聚甲醛溶液實(shí)際上是新鮮配制的甲醛液，甲醛溶解時(shí)大部分分子水合成水化甲醛，分子較大，主要固定組織的表面結(jié)構(gòu)，而小分子的甲醛主要是靠物理擴(kuò)散，或者其趨脂性滲入到組織中并與其內(nèi)部含有氨基的物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，如果固定時(shí)間太長，固定液與組織的交聯(lián)反應(yīng)過重，勢必影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【參考文獻(xiàn)】
  　�。�1］ 馬云，張燕，孫長華,等.固定液對原位雜交的影響［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2002,11(3):345.

　　［2］ 翟為溶,張錦生.現(xiàn)代組織化學(xué)的原理及應(yīng)用［M］.上海:上�？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,1998:182.

【固定時(shí)間對原位雜交的影響】相關(guān)文章：

樣本放置時(shí)間對血常規(guī)結(jié)果的影響08-30

增值稅轉(zhuǎn)型對固定資產(chǎn)核算的影響探討論文07-14

不同時(shí)間對新生兒聽力篩查的影響06-17

談述新高校會(huì)計(jì)制度執(zhí)行對高校固定資產(chǎn)的影響10-05

力學(xué)與固定關(guān)系的研究10-15

哲學(xué)對藝術(shù)的影響08-06

鈣對機(jī)體的影響09-06

企業(yè)固定資產(chǎn)管理的論文07-12

固定資產(chǎn)投資效益分析08-01